色譜及質(zhì)譜檢測中往往需要對目標物質(zhì)進行定量，目前使用較多的定量方法有面積歸一化法、單點校正法、外標法、內(nèi)標法、標準加入法等。

定量分析基本要求：

1、純物質(zhì)做標準

2、被定量組分峰要與其它峰達到基線分離（質(zhì)譜可不滿足）

3、符合定性參數(shù)要求

4、選擇合適的定量方法

定量分析基本公式：

在某些條件限定下，被測組分濃度與檢測器的響應(yīng)值成正比關(guān)系。（蒸發(fā)光散射檢測器濃度與峰面積不成線性，分別取對數(shù)后成線性）

C_i=f_iA_i或C_i=f_iH_i

C_i：組分濃度

f_i：響應(yīng)因子（與組分的理化性質(zhì)和檢測器的性質(zhì)有關(guān)）

A_i：組分響應(yīng)面積

H_i：組分響應(yīng)高度

實際修飾公式：Y=aX+b

一、面積歸一化法

把所有出峰的組分含量之和按100％計的定量方法，稱為歸一化法。當樣品中所有組分均能流出色譜柱，—并在檢測器上都能產(chǎn)生信號的樣品，可用歸一化法定量，其中組分i的質(zhì)量分數(shù)可按式計算:

歸一化法定量的主要問題是質(zhì)量校正因子的測定較為麻煩，雖然一些校正因子可以從文獻中查到或經(jīng)過一些計算方法算出，但要得到準確的校正因子，還是需要用每一組分的基準物質(zhì)直接測定。

氣相色譜的一些主要檢測器如FID和TCD對某些組分，如同系物的校正因子相近或有一定的規(guī)律，從文獻中可以查到或進行計算。當校正因于相近時，可直接用峰面積歸一化進行定量分，例如下表中給出了C8芳烴異構(gòu)體的分析結(jié)果。四個組分的FID檢測器的質(zhì)量校正因子在0.96-1.00之間，結(jié)果給出了用校正因子進行歸一化法的定量結(jié)果和直接用峰面積進行歸一化的定量結(jié)果。

比較兩個結(jié)果，誤差很小。在這種情況下直接用峰面積歸一是十分方便的，也是誤差范圍所允許的。

用 途：

用于雜質(zhì)檢查時，由于峰面積歸一化法測定誤差大，因此，本法通常只能用于粗略考察供試品中的雜質(zhì)含量。

除另有規(guī)定外，一般不宜用于微量雜質(zhì)的檢查。不能作為準確定量的方法，僅在特定情況下使用。

特 點：

1、無需校正（無標準曲線）

2、進樣量不嚴格要求

3、要求所有組分都流出并且被檢測到

4、要求所有組分的響應(yīng)因子相當

5、FID用的較多，校正響應(yīng)差異

6、假設(shè)所有fi均相同則

Wi%=mi/(m1+m2+m3+…+mi+…)*100%==Ai/(A1+A2+A3+…+Ai+…)*100%=Ci%

二、外標法

用待測組分的純品作對照物質(zhì)，以對照物質(zhì)和樣品中待測組分的響應(yīng)信號相比較進行定量的方法稱為外標法。此法可分為工作曲線法及外標一點法等。工作曲線法是用對照物質(zhì)配制一系列濃度的對照品溶液確定工作曲線，求出斜率、截距。

在完全相同的條件下，準確進樣與對照品溶液相同體積的樣品溶液，根據(jù)待測組分的信號，從標準曲線上查出其濃度，或用回歸方程計算，工作曲線法也可以用外標二點法代替。通常截距應(yīng)為零，若不等于零說明存在系統(tǒng)誤差。工作曲線的截距為零時，可用外標一點法(直接比較法)定量。

外標一點法是用一種濃度的對照品溶液對比測定樣品溶液中i組分的含量。將對照品溶液與樣品溶液在相同條件下多次進樣，測得峰面積的平均值，用下式計算樣品中i組分的量：

W＝A(W)／(A)

式中W與A分別代表在樣品溶液進樣體積中所含i組分的重量及相應(yīng)的峰面積。(W)及（A)分別代表在對照品溶液進樣體積中含純品i組分的重量及相應(yīng)峰面積。外標法方法簡便，不需用校正因子，不論樣品中其他組分是否出峰，均可對待測組分定量。但此法的準確性受進樣重復(fù)性和實驗條件穩(wěn)定性的影響。此外，為了降低外標一點法的實驗誤差，應(yīng)盡量使配制的對照品溶液的濃度與樣品中組分的濃度相近。

外標法 external standard method 色譜分析中的一種定量方法，它不是把標準物質(zhì)加入到被測樣品中，而是在與被測樣品相同的色譜條件下單獨測定，把得到的色譜峰面積與被測組分的色譜峰面積進行比較求得被測組分的含量。

外標物與被測組分同為一種物質(zhì)但要求它有一定的純度，分析時外標物的濃度應(yīng)與被測物濃度相接近，以利于定量分析的準確性。

C_i=f_iA_i+b 標準曲線擬合公式，f_i -i組分工作曲線斜率

特 點：

1、實驗室最常用的定量方法，定量結(jié)果較為準確

2、不需要所有峰都流出或被檢測到，只對目標組分校正

3、需要標準品

4、進樣量必須準確

5、儀器必須有良好的穩(wěn)定性

6、每個樣品分析的色譜條件（檢測器響應(yīng)性能、柱溫、流動相組成及流速，進樣量，柱效等）很難完全相同，因此容易出現(xiàn)較大誤差

7、對樣品前處理過程中被測組分的變化無法進行補償

三、單點校正法

當被測試樣中各組分濃度變化范圍不大時，可不必繪制多點標準曲線，而采用單點校正法（直接比較法）。配制一個和被測組分含量接近的標準溶液，定量進樣，依據(jù)被測組分和外標組分峰面積比或峰高比計算被測組分的含量。

W_i=f_iA_i，W_S=f_SA_S，f_i=f_S

W_i/W_S=A_i/A_S

i-被測組分；S-標準液組分

缺 點：

單點校正法實際上是利用原點作為標準工作曲線上的另一個點。因此，當方法存在較大系統(tǒng)誤差時（即標準工作曲線不通過原點），單點校正法的誤差較大。

四、內(nèi)標法

內(nèi)標法是一種間接或相對的校準方法。在分析測定樣品中某組分含量時，加入一種內(nèi)標物質(zhì)以校誰和消除出于操作條件的波動而對分析結(jié)果產(chǎn)生的影響，以提高分析結(jié)果的準確度。

內(nèi)標法在氣相色譜定量分析中是一種重要的技術(shù)。使用內(nèi)標法時，在樣品中加入一定量的標準物質(zhì)，它可被色譜拄所分離，又不受試樣中其它組分峰的干擾，只要測定內(nèi)標物和待測組分的峰面積與相對響應(yīng)值，即可求出待測組分在樣品中的百分含量。采用內(nèi)標法定量時，內(nèi)標物的選擇是一項十分重要的工作。

理想地說，內(nèi)標物應(yīng)當是一個能得到純樣的己知化合物，這樣它能以準確、已知的量加到樣品中去，它應(yīng)當和被分析的樣品組分有基本相同或盡可能一致的物理化學(xué)性質(zhì)(如化學(xué)結(jié)構(gòu)、極性、揮發(fā)度及在溶劑中的溶解度等)、色譜行為和響應(yīng)特征，最好是被分析物質(zhì)的一個同系物。

當然，在色譜分析條什下，內(nèi)標物必須能與樣品中各組分充分分離。需要指出的是，在少數(shù)情況下，分析人員可能比較關(guān)心化臺物在一個復(fù)雜過程中所得到的回收率，此時，他可以使用一種在這種過程中很容易被完全回收的化臺物作內(nèi)標，來測定感興趣化合物的百分回收率，而不必遵循以上所說的選擇原則。

在使用內(nèi)標法定量時，有哪些因素會影響內(nèi)標和被測組分的峰高或峰面積的比值?

影響內(nèi)標和被測組分峰高或峰面積比值的因素主要有化學(xué)方面的、色譜方面的和儀器方面的三類。

由化學(xué)方面的原因產(chǎn)生的面積比的變化常常在分析重復(fù)樣品時出現(xiàn)。

化學(xué)方面的因素包括：

1、內(nèi)標物在樣品里混合不好；

2、內(nèi)標物和樣品組分之間發(fā)生反應(yīng)，

3、內(nèi)標物純度可變等。

對于一個比較成熟的方法來說，色譜方面的問題發(fā)生的可能性更大一些，色譜上常見的一些問題(如滲漏)對絕對面積的影響比較大，對面積比的影響則要小一些，但如果絕對面積的變化已大到足以使面積比發(fā)生顯著變化的程度，那么一定有某個重要的色譜問題存在，比如進樣量改變太大，樣品組分濃度和內(nèi)標濃度之間有很大的差別，檢測器非線性等。進樣量應(yīng)足夠小并保持不變，這樣才不致于造成檢測器和積分裝置飽和。

如果認為方法比較可靠，而色譜固看來也是正常的話，應(yīng)著重檢查積分裝置和設(shè)置、斜率和峰寬定位。對積分裝置發(fā)生懷疑的最有力的證據(jù)是：面積比可變，而峰高比保持相對恒定，

在制作內(nèi)標標準曲線時應(yīng)注意什么?

在用內(nèi)標法做色話定量分析時，先配制一定重量比的被測組分和內(nèi)標樣品的混合物做色譜分析，測量峰面積，做重量比和面積比的關(guān)系曲線，此曲線即為標準曲線。

在實際樣品分析時所采用的色譜條件應(yīng)盡可能與制作標準曲線時所用的條件一致，因此，在制作標準曲線時，不僅要注明色譜條件(如固定相、柱溫、載氣流速等)，還應(yīng)注明進樣體積和內(nèi)標物濃度。

在制作內(nèi)標標準曲線時，各點并不完全落在直線上，此時應(yīng)求出面積比和重量比的比值與其平均位的標準偏差，在使用過程中應(yīng)定期進行單點校正，若所得值與平均值的偏差小于2，曲線仍可使用，若大于2，則應(yīng)重作曲線，如果曲線在鉸短時期內(nèi)即產(chǎn)生變動，則不宜使用內(nèi)標法定量。

內(nèi)標法的關(guān)鍵是選擇合適的內(nèi)標物。

試樣配制：準確稱取一定量的試樣W_i，加入一定量內(nèi)標物W_IS

W_i=f_iA_i，W_IS=f_ISA_IS

W_i=f_iA_i/f_ISA_IS*W_IS=f_i'A_i/A_IS*W_IS

f_i'為待測組分i對內(nèi)標物IS的質(zhì)量校正因子

將C_IS化歸為1則橫坐標即可直接讀出目標物濃度值C_i

特 點：

1、多用在國際標準和規(guī)定比較嚴格的方法中

2、臨床上檢測內(nèi)源性化合物應(yīng)用較多

3、進樣量的變化，色譜條件的微小變化對內(nèi)標法定量結(jié)果影響不大

4、樣品前處理（如濃縮、萃取，衍生化等）前加入內(nèi)標物，可部分補償被測組分樣品前處理過程的損失

5、樣品中必須加入等量的同一內(nèi)標物

6、操作相對繁瑣

7、內(nèi)標物的選擇較困難

內(nèi)標物選擇：

1、樣品中不存在且理化性質(zhì)與待測物一致

2、不與樣品中組分發(fā)生化學(xué)反應(yīng)

3、內(nèi)標物與待測物響應(yīng)相近

4、內(nèi)標物與待測物既能較好的分離，又不相距太遠（質(zhì)譜法同位素內(nèi)標物除外）

5、內(nèi)標物與待測物峰面積比在0.7-1.3范圍內(nèi)最好（根據(jù)待測物濃度確定內(nèi)標物的添加量）

6、常用的內(nèi)標物有同系物以及質(zhì)譜法常用的同位素內(nèi)標物如氘代內(nèi)標

五、標準加入法

標準加入法可以看作是內(nèi)標法和外標法的結(jié)合。當選擇不到合適的內(nèi)標物或無空白樣品時，以待測組分的純物質(zhì)為內(nèi)標物加入到待測樣品中，然后在相同的色譜條件下，測定加入待測組分純物質(zhì)前后的峰面積（或峰高），從而計算待測組分在樣品中含量的方法。

具體操作是取等量待測樣品若干份，加入不同濃度的待測組分的標準溶液進行分析，以濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標繪制工作曲線。工作曲線延長線在橫坐標上的截距即為樣品中待測組分的濃度。由于待測組分以及加入的標準溶液處在相同的樣品基體中，相當于把待測試樣作為了背景值。

但是，由于對每一個樣品都要配制三個以上的、含樣品溶液和標準溶液的混合溶液，因此，這種方法不適于大批樣品的分析。

W_i+W_添加=f_i'A_i'

當f_i=f_i'時，(W_i+ W_添加)/W_i=A_i'/A_i，即W_i= W_添加/(A_i'/A_i-1)

特 點：

1、只需欲測組分的純物質(zhì)，不需另外選擇內(nèi)標物

2、進樣量要準確

3、兩次色譜條件完全相同以保證校正因子完全相等

4、若在樣品的前處理之前就加入已知準確量的待測組分，則可以補償欲測組分在前處理過程中的損失，是色譜分析中較常用的定量分析方法

5、缺點是要求加入待測組分前后兩次色譜條件完全相同，以保證兩次測定時的校正因子完全相等，否則將引起分析測定的誤差

應(yīng)用外標法能夠滿足要求，首選外標法，畢竟外標法簡單省事。單從精密度方面去考慮，排除其它成本和效率的因素，內(nèi)標法優(yōu)于外標法。對結(jié)果精密度和準確度要求高時采用內(nèi)標法還是必要的。

內(nèi)標與外標都是定量的一種方法，各有優(yōu)缺點，要綜合考慮分析領(lǐng)域，分析要求和以及分析成本和分析效率等方面來選擇定量方法，找到簡單而有效的定量分析法才是最重要的。